【技术分享】参照USP129修订案建立单克隆抗体的SEC-UHPLC分析方法

继USP621修订版生效之后，美国药典又于2023年5月在PF49（3）中提议对通则<129治疗性重组单克隆抗体药物的分析方法(Analytical Procedures for Recombinant Therapeutic Monoclonal Antibodies) 进行修订：针对用于蛋白质SEC分析的L59型色谱柱，增加超高速、高性能的UHPLC色谱柱，即补充了单克隆抗体的SEC-UHPLC的分析方法。经过开放评议后，本次修订案作为USP-NF2024, Issue 3, 于2023年12月1日正式公布。如表1所示，对原有的L59型色谱柱尺寸（30 cm）增加了UHPLC专用的30 cm色谱柱。

表1. L59型色谱柱同时收录了TSKgel G3000SWXL和TSKgel UP-SW3000

一、从SEC-HPLC转换为SEC-UHPLC时的条件变更

USP中规定了使用L59型色谱柱分析抗体的多聚体、单体和片段。其中，比较有代表性的是将TSKgel G3000SWXL（5μm, HPLC）转换为TSKgel UP-SW3000-LS（2μm,UHPLC) 。除此以外，还可以将用于分离抗体片段的TSKgel G2000SWXL色谱柱转换为TSKgel UP-SW2000。将用于分离多聚体的TSKgel G4000SWXL（8μm）转换为TSKgel UP-SW Aggregate（3μm），分析条件的变更请参照表2。

表2.从HPLC色谱柱转换为UHPLC色谱柱时分离条件的变更

二、单克隆抗体的SEC-UHPLC分析实例

图1是在分析单克隆抗体时，从30cm的G3000SWXL色谱柱转换为15 cm的UP-SW3000-LS色谱柱，在保持同等分离度的前提下，分析时间缩短为50%，流动相减少约80%。

图1. SEC-HPLC (30 cm色谱柱) 转换为SEC-UHPLC (15 cm色谱柱) 的分离例